Texte de l'animation

Un 2eme exemple d’utilisation de techniques spectrales est le couplage de plusieurs réactions. Ici, le principe du système est différent : supposons que l’on veuille étudier une réaction catalysée par une enzyme E1. Dans cette réaction, ni le substrat ni le produit ne sont des chromophores. On couple alors une deuxième réaction, souvent une réaction de déshydrogénation. Le couplage se fait simplement parce que la réaction auxiliaire utilise le produit de la première réaction, appelée réaction principale, comme substrat. Pourquoi une réaction de déshydrogénation ? Parce que les déshydrogénases utilisent des coenzymes tels que le NADPH ou le NADH, comme ici, L’intérêt du couple NAD/NADH est qu’il possède un pic d’absorption caractéristique à 340 nm où seul le NADH absorbe. De ce fait, dans le couplage proposé, on suivra la réaction en mesurant une augmentation de l’absorbance à 340 nm. Pour qu’un couplage réussisse, c’est-à-dire pour que l’on puisse étudier la réaction catalysée par E1 en mesurant l'augmentation d’absorbance, donc l'augmentation de la concentration de NADH, il faut que le système remplisse deux types de conditions. D’abord, une condition cinétique : l’étape limitante doit être celle que l’on veut étudier. En d’autres termes, c’est la réaction que l’on souhaite étudier qui doit imposer sa vitesse à celle catalysée par la déshydrogénase de telle sorte que la variation de concentration du NADH corresponde exactement à la diminution de la concentration de A via E1. Puis une condition sur les concentrations : aucun équilibre ne doit pouvoir s’installer. Il suffit, dans ce cas, de mettre le substrat A en excès, ce qui, de toute manière est une condition pré requise pour être dans l’hypothèse de l’EQS, idem pour NAD+, et surtout ne mettre ni B ni NADH ni C. Expérimentalement, nous allons mettre dans le milieu, A et NAD+, les deux en excès, puis E2, et la réaction démarrera lorsque nous ajouterons, dans le mélange réactionnel, E1 : le chronomètre est déclenché et nous suivrons ainsi la réaction principale via l'augmentation du NADH, donc à travers la réaction auxiliaire. Si vous regardez de plus près le couplage proposé, vous remarquerez que, en fait, la deuxième enzyme utilise deux substrats. Je vais juste ouvrir une parenthèse sur les réactions plurisubstrats. Nous n’en avons pas encore parlé mais, la plupart des réactions biochimiques font intervenir deux substrats : elles représentent de l’ordre de 60% des réactions enzymatiques tandis que les réactions monosubstrats sont plutôt des exceptions. Dans le cas des réactions plurisubstrats, et bien qu’il existe plusieurs types de mécanismes, on définit toujours un équivalent KM pour chacun des substrats ainsi qu’une VM. Donc en gros, surtout si les systèmes sont résolus dans l’hypothèse du PER, la méthode de résolution des réactions plutisubstrats est tout à fait similaire à celle des réactions mono-substrat : il suffit d’avoir le mécanisme.