Texte de l'animation

Nous avons vu les différents mécanismes bi substrats et leurs résolutions dans l’hypothèse du PER. La question qui se pose maintenant est de savoir comment les différentier expérimentalement. La première chose dont il faut s’assurer est que l’enzyme fonctionne réellement avec deux substrats. En d’autres termes, il faut s’assurer que les composés sont véritablement des substrats et non des effecteurs. Cette vérification expérimentale est relativement facile à réaliser. Je vous rappelle qu’un effecteur est d’une part non essentiel pour la catalyse, c'est-à-dire que l’on doit observer une réaction enzymatique en son absence, contrairement au substrat, et d’autre part qu’il n’est pas métabolisé, transformé. Cette vérification étant faite, nous avons donc deux substrats et une enzyme : quel est le mécanisme qui les relie ? Existe-t-il ou non un complexe ternaire ? Un ordre de fixation ? Pour répondre à ces questions, l’expérimentateur doit réaliser toutes une série d’expériences. Il va mesurer la cinétique enzymatique en utilisant une concentration fixe en enzyme, une concentration fixe d‘un des substrats, qui sera le substrat paramétrique dans cette série de mesure, et faire varier la concentration de l’autre substrat. Puis refaire les mêmes expériences en inversant les deux substrats. L’interprétation de ces résultats nécessitera de tracer deux graphes primaires de Lineweaver-Burk. En effet, il faut systématiquement les graphes 1 sur v en fonction de A, B paramétrique et les graphes 1 sur v en fonction de B, A paramétrique. Si l’expérimentateur obtient ces graphes, alors le mécanisme est aléatoire avec interaction entre les sites. Ces graphes révèlent un mécanisme aléatoire sans interaction entre les sites. Un mécanisme ordonné est posé avec ces graphes. Le parallélisme de ces droites suggère un mécanisme ping pong. Lorsqu’un des graphes primaires montre un point de convergence en zéro, le mécanisme Théorell Chance est posé, et le substrat B et le second substrat.