Biochimie Structurale et Fonctionnelle - Pascale Bobillo
Plurisubstrat et Inhibiteurs compétitifs.

L’utilisation d’inhibiteurs compétitifs pour l’un des substrats permet de vérifier le mécanisme enzymatique entre les deux substrats.

Prenons un mécanisme ordonné et introduisons dans la cinétique un inhibiteur compétitif pour le second substrat ( B, dans ce schéma).

Mécanisme ordonné et Inhibiteur compétitif pour B

L'expérience est réalisée en deux temps: l'enzyme est d'abord incubée en présence d'une concentration variable en A, variable en I et saturante (et fixe) en B. Puis, dans une autre série, l'enzyme est incubée en présence d'une concentration variable en B, variable en I et saturante en A.

Equations utilisées :

  1. (E)T = (E) + (EA) + (EI) + (EAB)

  2. KA = (E) (A) / (EA)

  3. KB = (EA) (B) / (EAB)

  4. KI = (EA) (I) / (EAI)

  5. v = k (EAB)

  6. VM = k (E)T

Résolution :

[3] (EA) = [ KB / (B) ] (EAB)

[2] (E) = [ KA KB / (B) (A) ] (EAB)

[3] (EAI) = [ (I) / KI ] [ KB / (B) ] (EAB)

[1] (E)T = { 1 + [ KB / (B) ] [1 + ( (I) / KI )] + [ ( KB KA ) / ( (A) (B) ) ] } (EAB)

[6] v = ( k (E)T ) / { 1 + [ KB / (B) ] [1 + ( (I) / KI )] + [ ( KB KA ) / ( (A) (B) ) ] }

Mécanisme ordonné et Inhibiteur compétitif pour B : expression de la vitesse

Et pour une représentation de Lineweaver-Burk :

Mécanisme ordonné et Inhibiteur compétitif pour B : expression de l'inverse de la vitesse

MéthodeReprésentation de Lineweaver-Burk : 1 / v = f ( 1 / (A) ), (B) fixe et (I) paramétrique :

1/v = f (1 / (A) ), (B) fixe et (I) paramétrique

En traçant, pour une concentration en I donnée, une concentration en B fixe, 1 / v = f (1 / (A) ), on obtient une droite dont les caractéristiques sont :

1/v = f (1 / (A) ), (B) fixe et (I) paramétrique : expression du coefficient directeur 1/v = f (1 / (A) ), (B) fixe et (I) paramétrique : expression de l'intercept

1/v = f (1 / (A) ), (B) fixe et (I) paramétrique : expression de l'abscisse à l'origine

La pente est indépendante de la concentration en inhibiteur: toutes les droites seront donc parallèles (convergence à l'infini). Visuellement, en regardant le graphe 1 / v = f ( 1 / (A) ), (B) fixe et (I) paramétrique, l'interprétation est que I se comporte comme un inhibiteur in compétitif (ou conditionnel) vis à vis du substrat A.

MéthodeReprésentation de Lineweaver-Burk : 1 / v = f ( 1 / (B) ), (A) fixe et (I) paramétrique :

1/v = f (1 / (B) ), (A) fixe et (I) paramétrique

En traçant, pour une concentration en I donnée, une concentration en A fixe, 1 / v = f (1 / (B) ), on obtient une droite dont les caractéristiques sont :

1/v = f (1 / (B) ), (A) fixe et (I) paramétrique : expression du coefficient directeur 1/v = f (1 / (B) ), (A) fixe et (I) paramétrique : expression de l'intercept

1/v = f (1 / (B) ), (A) fixe et (I) paramétrique : expression de l'abscisse à l'origine

L'Ip est indépendant de la concentration en inhibiteur: toutes les droites convergeront sur l'axe des ordonnées. Visuellement, en regardant le graphe 1 / v = f ( 1 / (B) ), (A) fixe et (I) paramétrique, l'interprétation est que I se comporte comme un inhibiteur compétitif vis à vis du substrat B.

Voici les graphes:

Graphe :1/v = f (1 / (B) ), (A) fixe et (I) paramétrique
Graphe :1/v = f (1 / (A) ), (B) fixe et (I) paramétrique

Si, maintenant, on utilise un inhibiteur compétitif pour le premier substrat, A ici, les deux graphes 1 / v = f ( 1 / (A) ), (B) fixe et (I) paramétrique, et 1 / v = f ( 1 / (B) ), (A) fixe et (I) paramétrique, seront parfaitement symétrique; ils s'interprèteront tous les deux de la même façon: I est un inhibiteur compétitif pour le substrat A et un inhibiteur compétitif pour le substrat B.

Remarque

L'interprétation des quatres graphes permet de vérifier le mécanisme ordonné (avec B qui se fixe en second) entre les deux substrats.

Complément

La même démarche peut être faite pour les autres mécanismes et le tableau suivant résume les résultats ainsi obtenus:

Plurisubstrat et Inhibiteur compétitif