Biochimie Structurale et Fonctionnelle - Pascale Bobillo
Cinétique enzymatique à plusieurs substrats en pré-équilibre rapide (PER)

FondamentalRésolution en PER

Toute la résolution sera faite dans un premier temps dans l'hypothèse du pré-équilibre rapide, ( PER ), c'est-à-dire que les équilibres sont toujours vérifiés. En d'autres termes, les réactions de complexation des substrats avec l'enzyme ont atteint l'état d'équilibre avant libération du (des) produit(s).

Remarque

On rappelle que la vitesse, v, exprimée dans toutes les équations qui suivent, est la vitesse initiale de la réaction.

Mécanismes impliquant la formation d'un complexe ternaire

Mécanisme aléatoire avec interaction entre les sites

Le schéma est :

Mécanisme Aléatoire avec interactions

Avec : KiA différent de KA et KiB différent de KB.

Cela signifie que la fixation d'un substrat sur son site enzymatique modifie la fixation ultérieure de l'autre substrat sur son site.

Equations utilisées :

  1. (E)T = (E) + (EA) + (EB) + (EAB)

  2. KiA = (E) (A) / (EA)

  3. KiB = (E) (B) / (EB)

  4. KA = (EB) (A) / (EAB)

  5. KB = (EA) (B) / (EAB) et KiAKB = KAKiB

  6. v = k (EAB)

  7. VM = k (E)T

Résolution  :

  • [5] (EA) = [ KB / (B) ] (EAB)

  • [4] (EB) = [ KA / (A) ] (EAB)

  • [3] (E) = [ ( KB KIA ) / ( (A) (B) ) ] (EAB)

  • [1] (E)T = { 1 + [ KB / (B) ] + [ KA / (A) ] + [ ( KB KiA ) / ( (A) (B) ) ] } (EAB)

  • [6] v = ( k (E)T ) / { 1 + [ KB / (B) ] + [ KA / (A) ] + [ (KiA KB ) / ( (A) (B) ) ] }

  • [5] v = VM / { 1 + [ KB / (B) ] + [ KA / (A) ] + [ (KiA KB ) / ( (A) (B) ) ] }

v en fonction de (A) et (B)

et pour une représentation de Lineweaver-Burk. :

1/v en fonction de l'inverse de (A) et (B)

MéthodeReprésentation de Lineweaver-Burk. : 1 / v = f ( 1 / (A) ), (B) paramétrique.

L'expression devient:

1/v = f ( (A)), (B) paramétrique

En traçant, pour une concentration en B donnée, 1 / v = f ( 1 / (A) ), on obtient une droite dont les caractéristiques sont :

1/v = f ( (A)), (B) paramétrique : équation du coefficient directeur 1/v = f ( (A)), (B) paramétrique : équation de l'intercept

1/v = f ( (A)), (B) paramétrique : équation de l'abscisse à l'origine

Les droites 1 / v = f (1 / (A) ) convergeront à gauche de l'axe des ordonnées, au point de coordonnées :

1/v = f ( (A)), (B) paramétrique : Convergence en ordonnées et 1/v = f ( (A)), (B) paramétrique : Convergence en abscisse

Pour décrire complètement le système, il faut calculer trois des constantes (KiA, KiB, KA, et KB) ainsi que la VM . Il faut donc tracer des graphes secondaires (au moins deux).

Graphes secondaires:

  • Si on trace les valeurs de Ip du graphe primaire [ 1 / v = f ( 1 / (A) ) ] en fonction de l'inverse de (B) :

    1/v = f ( (A)), (B) paramétrique : équation de l'intercept

    Cette équation est celle d'une droite :

    1/v = f ( (A)), (B) paramétrique : P du graphe secondaire Ip 1/v = f ( (A)), (B) paramétrique : Ip du graphe secondaire Ip 1/v = f ( (A)), (B) paramétrique : a.o. du graphe secondaire Ip

  • Si on utilise les pentes en fonction de (B):

    1/v = f ( (A)), (B) paramétrique : P du graphe secondaire P 1/v = f ( (A)), (B) paramétrique : Ip du graphe secondaire P 1/v = f ( (A)), (B) paramétrique : a.o. du graphe secondaire P

MéthodeReprésentation de Lineweaver-Burk. : 1 / v = f ( 1 / (B) ), (A) paramétrique.

1/v = f ( (B)), (A) paramétrique

L'expression est parfaitement symétrique à celle du graphe 1 / v = f ( 1 / (A) )

En traçant, pour une concentration en A donnée, 1 / v = f ( 1 / (B) ), on obtient une droite dont les caractéristiques sont :

1/v = f ( (B)), (A) paramétrique : équation du coefficient directeur 1/v = f ( (B)), (A) paramétrique : équation de l'intercept

1/v = f ( (A)), (B) paramétrique : équation de l'abscisse à l'origine

Voici les deux graphes primaires:

Mécanisme Aléatoire avec interactions : les graphes primaires

Premier cas limite : Mécanisme aléatoire sans interaction entre les sites

Dans ce cas KA = KiA et KB = KiB.

Cela signifie que la fixation d'un substrat sur son site enzymatique ne modifie pas la fixation ultérieure de l'autre substrat sur son site. Les sites sont indépendants.

Mécanisme aléatoire sans interaction entre les sites

En utilisant la même méthode de résolution, on trouve:

expression de la vitesse en fonction des concentrations en (A) et (B)

Pour une représentation de Lineweaver-Burk :

inverse de la vitesse en fonction de l'inverse des concentrations en (A) et (B)

MéthodeReprésentation de Lineweaver-Burk : 1 / v = f ( 1 / (A) ) : (B) paramétrique

1/v = f ( 1/ (A) ), (B) paramétrique

En traçant, pour une concentration en B donnée, 1 / v = f ( 1 / (A) ), on obtient une droite dont les caractéristiques sont directement obtenues à partir des expressions générales :

1/v = f ( 1/ (B) ), (A) paramétrique : expression du coefficient directeur 1/v = f ( 1/ (B) ), (A) paramétrique : expression de l'intercept 1/v = f ( 1/ (B) ), (A) paramétrique : expression de l'abscisse à l'origine

L'a.o. est indépendante de la concentration en substrat B: toutes les droites convergeront en ce point. Les coordonnées du point de convergence sont donc:

1/v = f ( 1/ (B) ), (A) paramétrique : Convergence en ordonnée et 1/v = f ( 1/ (B) ), (A) paramétrique : Convergence en abscisse

Graphes secondaires:

  • En traçant: p = f ( 1 / (B)):

    1/v = f ( 1/ (B) ), (A) paramétrique : expression du coefficient directeur en fonction de (B)

    Cette équation est celle d'une droite :

    1/v = f ( 1/ (B) ), (A) paramétrique : expression du coefficient directeur du graphe secondaire 1/v = f ( 1/ (B) ), (A) paramétrique : expression du coefficient directeur du graphe secondaire 1/v = f ( 1/ (B) ), (A) paramétrique : expression de l'abscisse à l'origine du graphe secondaire

On peut tracer un autre graphe secondaire: Ip = f ( 1 / (B) ), mais on ne peut pas, bien évidemment, utiliser l'a.o.

MéthodeReprésentation de Lineweaver-Burk. : 1 / v = f ( 1 / (B) ), (A) paramétrique.

1/v = f ( 1/ (B) ), (A) paramétrique

Le résultat est symétrique du précédent.

Voici les deux graphes primaires:

Mécanisme aléatoire sans interaction entre les sites

Deuxième cas limite : Mécanisme ordonné

KiB = 0 et KA= 0. Pour simplifier l'écriture KiA devient KA

Mécanisme ordonnée

Cela signifie que B ne peut se fixer sur son site enzymatique que si A se trouve déjà fixé.

En utilisant la même méthode de résolution, on trouve:

Mécanisme ordonnée : expression de la vitesse

Pour une représentation de Lineweaver-Burk :

1/v en fonction de l'inverse des concentrations en (A) et (B)

MéthodeReprésentation de Lineweaver-Burk : 1 / v = f ( 1 / (A) ), (B) paramétrique :

1/v = f ( 1 / (A)), (B) paramétrique

En traçant, pour une concentration en B donnée, 1 / v = f ( 1 / (A) ), on obtient une droite dont les caractéristiques sont :

1/v = f ( 1 / (A)), (B) paramétrique : expression du coefficient directeur 1/v = f ( 1 / (A)), (B) paramétrique : expression de l'intercept 1/v = f ( 1 / (A)), (B) paramétrique : expression de l'abscisse à l'origine

Les trois paramètres dépendent de la concentration en substrat paramétrique: le point de convergences des droites se trouve hors des axes.

1/v = f ( 1 / (A)), (B) paramétrique : convergence en ordonnéeet 1/v = f ( 1 / (A)), (B) paramétrique : convergence en abscisse

Graphes secondaires:

On peut utiliser les trois paramètres pour tracer un graphe secondaire. Ici, l'exemple traitera de l'utilisation de l'a.o.qui est un peu particulière dans ce modèle.

  • En traçant: a.o. = f ( (B) ):

    1/v = f ( 1 / (A)), (B) paramétrique : expression de l'abscisse à l'origine en fonction de (B)

    on obtient une droite :

    Graphe secondaire, a.o. = f((B)), expression du coefficient directeur Graphe secondaire, a.o. = f((B)), expression de l'intercept Graphe secondaire, a.o. = f((B)), expression de l'abscisse à l'origine

MéthodeReprésentation de Lineweaver-Burk : 1 / v = f ( 1 / (B) ), (A) paramétrique :

1/v = f ( 1 / (B)), (A) paramétrique

En traçant, pour une concentration en A donnée, 1 / v = f (1 / (B) ), on obtient une droite dont les caractéristiques sont :

1/v = f ( 1 / (A)), (B) paramétrique : expression du coefficient directeur 1/v = f ( 1 / (B)), (A) paramétrique : expression de l'intercept 1/v = f ( 1 / (B)), (A) paramétrique : expression de l'abscisse à l'origine

L'Ip est indépendant de la concentration en substrat B: toutes les droites convergeront en ce point. L'Ip ne pourra pas être utilisé pour construire un graphe secondaire. Les coordonnées du point de convergence sont donc:

1/v = f ( 1 / (A)), (B) paramétrique : convergence en abscisse et1/v = f ( 1 / (A)), (B) paramétrique : convergence en ordonnée

Voici les deux graphes primaires:

Mécanisme ordonnée : les deux graphes primaires

Mécanismes excluant la formation d'un complexe ternaire

Mécanisme Ping Pong

Mécanisme Ping pong

E' est l'enzyme modifiée (par acétylation, phosphorylation....). Le système ne peut être résolu que si la vitesse d'apparition de P est égale à celle de Q.

Equations utilisées :

  1. (E)T= (E) + (EA) + (E'B) + (E')

  2. KA = (E) (A) / (EA)

  3. KB = (E') (B) / (E'B)

  4. v = d(P) / dt = d(Q) / dt = k1(EA) = k2 (E'B)

  5. VM = k1 (EA)Max = k2 (E'B)Max

Remarque

La vitesse maximale est atteinte lorsque toute l'enzyme est complexée, soit : (E)T = (EA)Max + (E'B)Max

Résolution

  • [4] (E’B) = k1 (EA) / k2 et (E’B)Max = k1 (EA)Max / k2.

  • (E)T = (EA)Max (1 + ( k1 / k2 ) ) = (EA)Max ( k1 + k2 ) / k2

  • [5] VM = k1 (EA)Max = k1 k2 (E)T / ( k1 + k2 )

  • [2] (E ) = KA (EA) / (A)

  • [3] (E’) = KB (E’B) / (B)

  • [1] (E)T = (EA) [ 1 + KA / (A) ] + (E’B) [ 1 + KB / (B) ]

  • (E)T = (EA) {[ 1 + KA / (A) ] + [ 1 + KB / (B) ] k1 / k2}

  • [4] vi = k1 (E)T /{[ 1 + KA / (A) ] + [ 1 + KB / (B) ] k1 /k2}

    = [ k1 k2 (E)T / (k1 + k2 )] / {k1 k2 / (k1 + k2 )} {[ 1 + KA / (A) ] + [ 1 + KB / (B) ] k1 / k2}

    = VM / {[k2 / (k1 + k2 )] [ 1 + KA / (A) ] + [k2 / (k1 + k2 )] [ 1 + KB / (B) ] k1 / k2}

    = VM / { 1 + [k2 / (k1 + k2 )] [ KA / (A) ] + [k1 / (k1 + k2 )] [ KB / (B) ] }

En posant:

Mécanisme Ping pong :K'A et Mécanisme Ping pong :K'B

avec: Mécanisme Ping pong :VM

D'où:

Mécanisme Ping pong :expression de la vitesse

Et pour une représentation de Lineweaver-Burk :

Mécanisme Ping pong :inverse de la vitesse en fonction de l'inverse des concentrations en (A) et (B)

MéthodeReprésentation de Lineweaver-Burk : 1 / v = f ( 1 / (A) ), (B) paramétrique :

1/v = f ( 1 / (A) ) (B) paramétrique

1/v = f ( 1 / (A) ) (B) paramétrique : expression du coefficient directeur 1/v = f ( 1 / (A) ) (B) paramétrique : expression de l'intercept 1/v = f ( 1 / (A) ) (B) paramétrique : expression de l'abscisse à l'origine

La pente est indépendant de la concentration en substrat B: toutes les droites seront donc parallèles: la convergence est à l'infini. La pente ne pourra pas être utilisée pour construire un graphe secondaire.

MéthodeReprésentation de Lineweaver-Burk : 1 / v = f ( 1 / (B) ), (A) paramétrique :

1/v = f ( 1 / (B) ) (A) paramétrique

Cette expression est parfaitement symétrique de la précédente.

Voici les deux graphes primaires:

Mécanisme Ping pong : les deux graphes primaires

Theorell Chance

Le schéma est :

Mécanisme Théorell Chance

Ici, il n'y a pas de saturation possible en B.

Equations utilisées :

  1. (E)T= (E) + (EA)

  2. KA = (E) (A) / (EA)

  3. v = d(P) / dt = d(Q) / dt = k (EA) (B)

  4. VM = k (E)T

Résolution:

On trouve:

Mécanisme Théorell Chance : expression de la vitesse

Et pour une représentation de Lineweaver-Burk :

Mécanisme Théorell Chance : inverse de la vitesse en fonction des concentrations en A et B

MéthodeReprésentation de Lineweaver-Burk : 1 / v = f ( 1 / (A) ), (B) paramétrique :

Mécanisme Théorell Chance : 1/v = f (1 / (A) ), B paramétrique

En traçant, pour une concentration en B donnée, 1 / v = f (1 / (A) ), on obtient une droite dont les caractéristiques sont :1/v = f (1 / (A) ), B paramétrique : expression du coefficient directeur 1/v = f (1 / (A) ), B paramétrique : expression de l'intercept 1/v = f (1 / (A) ), B paramétrique : expression de l'abscisse à l'origine

L'a.o. est indépendante de la concentration en substrat B: toutes les droites convergeront en ce point. L'a.o ne pourra pas être utilisé pour construire un graphe secondaire. Les coordonnées du point de convergence sont donc:

1/v = f (1 / (A) ), B paramétrique :convergence en abscisse 1/v = f ( 1 / (A)), (B) paramétrique : convergence en ordonnée

MéthodeReprésentation de Lineweaver-Burk : 1 / v = f ( 1 / (B) ), (A) paramétrique :

En traçant, pour une concentration en A donnée, 1 / v = f (1 / (B) ), on obtient une droite dont les caractéristiques sont :

1/v = f (1 / (B) ), (A) paramétrique : expression du coefficient directeur 1/v = f ( 1 / (B)), (A) paramétrique : expression de l'intercept 1/v = f ( 1 / (B)), (A) paramétrique : expression de l'abscisse à l'origine

Un résultat directement fourni par les caractéristiques de ce graphe primaire, est que l'origine est indépendante de (A). Les droites 1 / v = f (1 / (B) )convergeront donc sur l'origine des axes, donc au point de coordonnées :1/v = f ( 1 / (A)), (B) paramétrique : convergence en abscisse 1/v = f ( 1 / (A)), (B) paramétrique : convergence en ordonnée

Voici les deux graphes primaires:

Mécanisme Théorell Chance : les deux graphes primaires